冲田杏梨在线观看,女沟厕偷窥piss小便,国精产品一区一区三区有限在线,少妇被粗大的猛烈进出免费视频

產(chǎn)品列表 / products

首頁 > 技術(shù)文章 > 探索超低溫冷凍對綿羊卵母細(xì)胞四跨膜蛋白CD9的影響

探索超低溫冷凍對綿羊卵母細(xì)胞四跨膜蛋白CD9的影響

點(diǎn)擊次數(shù):2880 更新時(shí)間:2017-06-21

 儲存型液氮罐選型列表>>

1.卵母細(xì)胞的采集和體外成熟培養(yǎng)(IVM)

從屠宰場收集的新鮮綿羊卵巢,放在滅菌過并預(yù)熱的37℃、0.9%生理鹽水保溫杯中,送到實(shí)驗(yàn)室。再用同樣生理鹽水清洗卵巢2~3遍,直至干凈。使用抽吸法吸取卵泡液,顯微鏡下篩取顆粒細(xì)胞緊密的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs),放入預(yù)先加熱的采卵液和成熟液各洗3次,放入成熟微滴中,CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23~24h。培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后使用透明質(zhì)酸酶去顆粒細(xì)胞進(jìn)行10~15min的消化。在顯微鏡下挑選形態(tài)完整、胞質(zhì)均勻并排出*極體的卵母細(xì)胞。

2.卵母細(xì)胞的冷凍保存

BS、VS、ES預(yù)先在室溫下平衡20min左右,再把處理好的細(xì)胞放入BS中稍微洗滌后就移入ES中停留5~10min,經(jīng)過皺縮又復(fù)張到原先大小的80%為止,再移入VS后一并吸入冷凍管中,投入液氮罐中進(jìn)行冷凍保存。

3.解凍

將1.0mol/L蔗糖溶液37℃預(yù)熱20min,再將1.0、0.5、0.25mol/L蔗糖溶液和BS分別放入預(yù)熱的4孔皿中,室溫下平衡20min。將冷凍細(xì)胞分別在上述梯度蔗糖溶液中分別放置3min,后轉(zhuǎn)入BS中,緩慢升溫5min,即可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

4.免疫組化

用預(yù)熱的生理鹽水清洗卵巢后放入4%多聚甲醛中,4℃固定24h,然后移入30%蔗糖溶液中脫水,脫水至卵巢在自然狀態(tài)下下沉至底部即可。將處理好的卵巢放入冷凍切片機(jī)里冷凍30min,用O.C.T.包埋。切片厚度為10μM的卵巢放在防脫載玻片上放進(jìn)PBS溶液中4℃過夜。用0.1%TritonX-100里通透30min,用PBS在脫色搖床上搖洗3次,每次10min。然后放入CD9一抗Anti-CD9Antibody(1:100)(陰性對照加PBS代替一抗)中4℃過夜。經(jīng)一抗孵育的切片用PBS搖洗3次,每次10min后室溫?fù)u床孵育二抗GoAtAnti-rAbbitI9GH&L(1:200)孵育1~2h,再用PBS搖洗3次,每次10min。DAPI室溫孵育5min,PBS搖洗3次,后滴加抗熒光淬滅劑,即可熒光顯微鏡觀察。

5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR

(1)綿羊卵母細(xì)胞總RNA的提取 RNA提取依據(jù)微量樣品總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。卵母細(xì)胞的收集同1.2.1、1.2.2和1.2.3步驟,各收集300個(gè)新鮮GV期、MⅡ期卵母細(xì)胞和冷凍GV期、MⅡ期卵母細(xì)胞,離心去上清加入350μL終濃度1%裂解液,再加5μL的4ng/μLCArrierNA工作液,勻漿,加入1倍體積70%乙醇,再將所有液體移入吸附柱crⅠ上放進(jìn)離心管里,12000r/min離心1min,棄廢液。加350μL去蛋白液,12000r/min離心1min,棄廢液。管中加80μL配制好得dnAsEⅠ工作液,室溫放置15min加350μL去蛋白液,12000r/min離心1min,棄廢液。再加500μL漂洗液,室溫放置2min,12000r/min離心1min,棄廢液。12000r/min離心2min,棄廢液,置于室溫?cái)?shù)分鐘以*曬干殘余漂洗液。將吸附柱crⅠ放入新的離心管中,加入14μLrNAse-freeddh20,室溫放置2min,13000r/min離心2min,所得溶液為RNA溶液。用酶標(biāo)儀測定RNA的D260nm/D280nm值。

(2)總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 按照Pri-mESCriptTMrTMAsterMix(PerfectreAl-time)試劑盒說明書,PCR反應(yīng)總體系為20μL:5×Prime-ScriptTMrTMAsterMix4μL,rNA5.5μL,rNAse-freeddh2O10.5μL。輕輕混勻,37℃15min,85℃5s,溫度降到4℃終止反應(yīng),-80℃保存。

(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 利用SYBr PreMixExTAqTMⅡ檢測綿羊卵母細(xì)胞CD9基因的相對表達(dá)量。引物序列見表1

 

 

PCR擴(kuò)增體系20μL:SYBR(PreMixExTAqTMⅡ(2×)10μL,ROXReferenceDye(50×)0.4μL,上、下游引物(10μMoL/L)各0.5μL,RNAse-free ddH2O7.6μL,cdnA1μL。每個(gè)樣品做3個(gè)技術(shù)重復(fù)和3個(gè)平行試驗(yàn)。PCR反應(yīng)程序:95℃30s;95℃30s,61℃30s,72℃20s;95℃1Min,55℃30s;95℃30s。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)所得ct值計(jì)算CD9mRNA的相對表達(dá)量,采用sAs軟件中GLM進(jìn)行方差分析,并使用鄧肯氏多重比較,P<0.05為差異顯著。

6.Western blotting分析 卵母細(xì)胞的蛋白提取采用了細(xì)胞總蛋白提取的方法。同1、2和3步驟收集新鮮GV期、MⅡ期卵母細(xì)胞和冷凍GV期、MⅡ期卵母細(xì)胞各500個(gè),10000R/Min離心2Min,棄上清液。震蕩至細(xì)胞沉淀*擴(kuò)散。加28μLRiPA裂解液,用超聲波破碎儀破碎數(shù)秒后再加2μLPMSF蛋白酶抑制劑和2μLβ-巰基乙醇,整個(gè)過程均在冰上進(jìn)行,后加8μLSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)充分混合后,95℃變性5Min。配制5%濃縮膠和12%分離膠,進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。在20MA電流、20MV恒壓的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,取出PVdF膜后放入封閉液中,室溫?fù)u床1~2h,以便去掉膜上的非特異性蛋白,提高目的蛋白與抗體的特異性結(jié)合。分別放入Anti-CD9Antibody(1:1000)和MsMAbtobEtAActin(1:2000)中,4℃過夜。取出與一抗孵育的膜,用洗膜液搖洗3次,每次10Min。再分別與CD9二抗donKEyAnti-RAbbitiGGh&L(hRP)(1:2000)和β-Actin二抗GoAtAnti-MousEiGG(h&L)hRPconJuGAtEd(1:2000)在室溫?fù)u床孵育1~2h,洗滌3次,每次10Min,dAb染色,觀察結(jié)果。

15611258074
在線咨詢
丰满熟妇岳av无码区hd| 亚洲欧美妆和亚洲妆的区别| 欧美一区二区三区视频在线观看| 美女扒开尿口让男人桶| 天天澡天天狠天干天啪啪图片| 将军边走边挺进她的小泬| 嗯灬啊灬把腿张开灬a片| 999久久久免费精品国产| 免费人成在线观看网站| 免费av在线观看| 少妇人妻人伦a片| 一本狠狠色丁香婷婷综合久久| 日本japanese熟睡人妻| 无翼鸟邪恶漫画| 性一交一乱一交a片久久四色| 色戒在线免费观看| av视频在线观看| 西西人体www大胆高清视频| 肉色超薄丝袜脚交一区二区| 和山田进行lv999的恋爱| 国产gv天堂亚洲国产gv刚刚碰| 车后座挺进朋友人妻女友| 欧美精产国品一二三产品区别在哪| 总裁攻紧致h粗大学生受小说| 国产精品永久久久久久久久久 | 狠狠躁夜夜躁人人爽 | 七十路熟女のお婆ち| 少妇┅┅快┅┅用力| 18禁喷水流白浆自慰视噜噜噜 | 国产真实偷人视频| 国产精品沙发午睡系列99| 新婚娇妻陪局长出差bd| 日韩精品一区二区三区在线观看| 免费web服务器网站| 黑人40厘米全部进去a片| 久久综合九色综合欧美狠狠| 天天摸日日摸狠狠添高潮喷| 翁止熄痒苏钥第9章| 舌尖伸入湿嫩蜜汁呻吟| 闺蜜扒开我的腿用黄瓜折磨我| 高清欧美videossexo|